产品货号：
KL221019
中文名称：
miRNA反转录试剂盒(U6启动子)
英文名称：
microRNA Reverse Transcription Kit(U6 Promoter)
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品特点：
产品组成：
保存：-20℃，有效期1年。
溶液配制：
使用方法：
一、合成PCR用的1st-strand cDNA
二、合成建文库用的1st-strand cDNA
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本试剂盒提供合成cDNA第一链合成所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）以RNA为模板，高效合成cDNA。
产品特点：
- 使用突变的反转录酶，内源RNase H活性低，使得在逆转录过程中RNA模板不容易被降解，得到的cDNA平均长度更长。
- 最长可合成13kb的cDNA。
- 可以使用oligo-dT、随机引物和RNA专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。
- 总RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA均可作为模板。
- 得到的cDNA可用于后续的cDNA文库构建、RT-PCR、探针标记等。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| MMLV反转录酶(含RI) | 50mL |
| 4×RT Buffer(含dNTP) | 250mL |
| Oligo (dT)12-18引物干粉 | 25mg |
| 随机引物(6碱基，无修饰)干粉 | 10mg |
| 超纯水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期1年。
溶液配制：
首次使用本制品时，需要在Oligo (dT)12-18引物干粉管中加入50mL超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.5μg/mL的Oligo (dT)12-18引物溶液；需要在随机引物(6碱基，无修饰)干粉管中加入50μL超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.2mg/mL的随机引物溶液。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。
使用方法：
一、合成PCR用的1st-strand cDNA
- 在一干净的反应管中加入RNA模板。
RNA模板种类 加入量 总RNA 100～500ng 或poly(A) mRNA 10～500ng 或专一的RNA 0.01pg～500ng RNA模板不能含有基因组DNA污染。 - 加入引物和水。
成分 用量 引物种类 加入量 Oligo (dT)12-18，0.5μg/μL 1mL 或随机引物(6碱基，无修饰)，0.2μg/μL 1mL 或RNA模板专一性引物 15-20pmol 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。 - 加水到13μL。
- 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
- 再加入5μL 4×RT Buffer（含dNTP）。
- 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成25℃ 5分钟以便其跟RNA结合。
- 加入1μL MMLV反转录酶（含RI），反应终体积为20mL。
- 42℃保温60分钟。但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，待合成了一段cDNA后，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
- 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
二、合成建文库用的1st-strand cDNA
- 在一干净的反应管中加入RNA模板。
RNA模板种类 加入量 poly(A) mRNA 1mg 或专一的RNA 0.5～1mg RNA模板不能含有基因组DNA污染。 - 加入引物
引物种类 加入量 Oligo (dT)12-18，0.5μg/μL 1mL 或随机引物(6碱基，无修饰)0.2μg/μL 1mL 或RNA模板专一性引物 100pmol 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。 - 加水到13μL。
- 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
- 再加入5μL 4×RT Buffer（含dNTP）。
- 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟。
- 加入2μL MMLV反转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
- 42℃保温60分钟，但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
- 70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃长期保存。
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